中药诱导肿瘤细胞凋亡研究进展

    细胞凋亡(apop tosis)又称为程序性死亡,是由基因控制的细胞自我消亡过程。其特征是质膜保持完整性,而核染色质固缩,内源性内切酶激活,将染色质DNA 降解成寡聚小体,电泳带谱表现为特征性梯状带,无整个组织的破坏和炎性反应。1992年英国科学家Hickman等首次提出可以将诱导肿瘤细胞凋亡作为以后肿瘤治疗研究的主要目标和手段, 诱导肿瘤细胞凋亡治疗逐渐成为国际肿瘤研究的一个热点。近年研究表明,许多中药的有效成分或其提取液具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,中药诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制主要有以下几个方面。

    1　阻滞肿瘤细胞增殖周期　　　

    一般而言,每一代肿瘤细胞的增殖周期都需要依次经历 G1期、S期、G2期、M期四个阶段。许多中药的有效成份能够作用于细胞周期的某一环节,从而使细胞增殖周期受阻, 诱导其发生凋亡。用藤梨根氯仿提取液处理人肺腺癌A549 细胞,可以对细胞周期产生影响,表现为G0/G1期细胞增多, S期和G2/M期细胞减少,出现G0/G1期阻滞,并呈现一定的剂量依赖关系,伴PI染色检测的细胞凋亡率增加,提示藤梨根氯仿提取液可抑制A549细胞的有丝分裂,诱导肿瘤细胞凋亡。Li等报道黄连提取物及其主要成分小檗碱都可以在不影响CyclinB1 mRNA表达情况下,抑制CyclinB1 蛋白活性,但不抑制Cyclin A～Cyclin E蛋白活性,使cdc2激酶活性降低,细胞进入有丝分裂受阻滞,被阻滞在G2期。某些药物可以阻滞肿瘤细胞由S期进入G2/M期而诱发其凋亡。左云飞等研究发现, 榄香烯对肝癌腹水瘤细胞系 Hca2F25/CL216A3的G0/G1期细胞无明显作用,主要作用在S期,阻止细胞由S期进入G2/M期,从而抑制肿瘤生长。并观察到在G0/G1期前出现一个凋亡特异的AP峰。黄志煜等报道小檗胺可抑制人白血病Jurkat细胞的增殖,使细胞阻滞在S期, G0/G1期细胞比例也有减少,同时并也观察到肿瘤细胞凋亡明显增加。　　

    较多的中药通过阻滞肿瘤细胞于G2/M期而发挥诱导细胞凋亡的作用。马东礼等在研究榄香烯对HeLa细胞的作用时发现, HeLa细胞增殖受到明显的抑制,细胞的分裂能力降低,绝大多数细胞阻滞在G2/M期。张曼颖等研究发现,刺五加叶皂苷能诱导肺癌细胞Spc2A21凋亡,细胞周期分析发现, G0/G1和S期细胞比例明显降低, G2/M期细胞明显升高,提示刺五加叶皂苷作用也是使SPC-A-1 细胞阻滞于 G2/M期。毛兰素是从鼓槌石斛中分离得到的,也可以阻滞人早幼粒细胞白血病HL260细胞于G2/M期,并伴Bcl-2表达下调,Bax表达上调,诱导肿瘤细胞凋亡。

    2　影响癌基因和抑癌基因的表达　　　

    在肿瘤的发生发展过程中,肿瘤细胞表达的凋亡相关基因起重要的调控作用,其中的某些基因发生缺失,突变或过度表达,可导致细胞增殖失控或凋亡受阻。因此,如何调控凋亡相关基因或其相应产物,提高肿瘤细胞对药物的敏感性,并诱导细胞进入凋亡是肿瘤治疗取得成功的关键。目前 bcl-2、c-myc、p53是几个了解较为深入的、与凋亡调控有关的基因。　　

    野生型p53(wtp53)基因的主要生物学功能为引起细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡和促进分化,对细胞生长起负调控作用,而因基因缺失或突变产生的突变型P53(mtp53)蛋白则对细胞的增殖和转化起促进作用,抑制细胞凋亡,导致肿瘤的发生。p53基因发生突变是许多人类恶性肿瘤中常见的基因改变之一。实验证明,大蒜素通过促进抑癌基因 p53和p21的表达诱导人早幼粒细胞白血病HL260细胞和胃癌BGC-823 细胞凋亡。Wilson 等发现金雀异黄素 (genistein)能诱导大肠癌HCT2116细胞的抑癌基因-非甾体抗炎药活化基因NAG21和p53、p21的表达,并通过诱导p53 基因来调节NAG21的表达。而在大肠癌HCT215细胞(p53 基因缺失)中NAG21不能被诱导表达,提示金雀异黄素通过调节p53基因而诱导肿瘤细胞凋亡。　　

    郭伟剑等采用血清药理学方法研究健脾理气药(党参、白术、茯苓、八月札等)的体外诱导凋亡效应。结果显示, 含中药血清作用2天后,诱导肝癌细胞凋亡,使细胞周期阻滞于S期,并上调p53蛋白的表达,提示上调p53蛋白的表达可能为健脾理气药诱导肝癌SMMC7721细胞凋亡的分子机制之一。抗癌口服液(由人参、灵芝和白花蛇舌草组成的复方水煎汤剂)作用于人胃癌MGC2803细胞株,发现其具有明显抑制增殖和诱导凋亡作用,用药前后凋亡相关基因p53 蛋白、Bcl-2蛋白表达均减少,而Fas抗原表达明显增高,差别均有显著性改变。　　

    原癌基因bcl-2、c-myc是主要的凋亡调控基因。bcl-2能抑制细胞凋亡, bcl22受抑制被认为可能是细胞凋亡的共同通道。而bax基因则倾向于分布在终末分化细胞、退化细胞,在凋亡旺盛的细胞中表达更强,在功能上与bcl-2相反, 其过度表达则触发凋亡。袁怀波等用RT2PCR和蛋白质免疫印迹技术,发现葛根黄酮提取物、葛根素和大豆苷元处理HL260细胞后能够上调bax mRNA表达水平,下调Bcl-2 蛋白表达和上调bax蛋白表达。姚保泰等研究,发现盐酸小檗碱可通过下调bcl-2的表达而达到防治胃癌及癌前病变的目的。左小东等研究华蟾素诱导肿瘤细胞凋亡与细胞周期阻断和抗凋亡基因bcl-2表达之间的关系。结果华蟾素能将肿瘤细胞阻断在S期,并能抑制bcl-2基因的表达。马靖等研究表明, c-myc、c-jun和c-fos上调参与甘草诱导肿瘤细胞凋亡的调控。何承伟等研究半边旗提取物6F对 HL260细胞内c-myc、bcl-2及增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响,发现给予6F 8～231nmol/L,作用HL260细胞12小时,流式细胞分析示c2myc、bcl-2及PCNA蛋白表达水平明显下降,并呈剂量效应关系。　　

    因此,中药诱导肿瘤细胞凋亡的机制可能与一些癌基因和抑癌基因的表达改变有关,但其中可能的具体机制仍需进一步研究。

    3　抑制端粒酶活性　　　

    端粒酶可能是目前已知的最广谱的恶性肿瘤分子标记物,并且与细胞周期和肿瘤凋亡基因表达关系密切。因此, 鉴于端粒酶在肿瘤发生和发展中所扮演的重要角色,端粒酶活性的抑制可能是某些抗癌药物发挥作用的机制。陈伟忠等利用TRAP-EL ISA法半定量检测了不同浓度的苦参碱对肝癌细胞HepG-2端粒酶活性的影响。结果显示,苦参碱对HepG-2的端粒酶活性有一定的抑制作用。同时认为苦参碱抗肿瘤的机制可能与抑制hTERT表达、降低端粒酶活性有关。曾建新等实验发现,肝癌HCC-9204细胞中端粒酶活性较高,而当用AS2O3处理48小时后,测得端粒酶活性显著降低,提示抑制端粒酶活性是AS2O3诱导肝癌细胞凋亡的机制之一。黎丹戎等实验表明,茶多酚具有诱导BEL-7402细胞分化的作用,并能降低端粒酶活性的表达。同时并没有发现发生分化的细胞端粒酶活性不下降的情况。说明端粒酶的活性抑制是细胞分化过程所伴有的, 提示茶多酚的抗癌机制可能是通过抑制端粒酶的活性而实现。李伏娥等用PCR-EL ISA法对胃癌细胞端粒酶活性进行检测,苦参碱在诱导细胞凋亡的同时伴随端粒酶活性下调,且随苦参碱浓度增大和时间延长,抑制作用逐渐增强。提示苦参碱诱导细胞凋亡的调控可能与端粒酶表达调控之间存在密切联系。　　

    韩国槲寄生中的凝集素能抑制肝癌细胞端粒酶活性,桔梗属grandiflorum 的水提取物能抑制肺癌细胞株 A549端粒酶活性。姜黄素能诱导白血病细胞株HL-60 细胞和卵巢癌K562细胞凋亡,伴有端粒酶活性抑制, 且表现为浓度依赖性。柴胡属中的scorzonerifolium也能诱导肺癌细胞株A549 细胞凋亡并能抑制其端粒酶活性。　　

    目前,多数研究认为,这些药物抑制肿瘤细胞端粒酶活性可能是诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一。

    4　影响细胞凋亡信号传导　　　

    caspase是一个半胱氨酸蛋白酶家族, 是细胞凋亡的主要执行者。已发现的14种caspase均以酶原(procaspase)形式存在并定位于细胞内不同的亚细胞部位。caspase28基因位于染色体2q33-34。caspase28 也称MACH、FL ICE、Mch5, 1996年被克隆成功, 以无活性的酶原(procaspase28)形式存在于成人及除胎儿脑组织外的各种组织中, 在外周血白细胞中分布较高。p rocaspase-8 有479 个氨基酸, 分子量为 55kD, 其8种异构体中2种有完整的酶活性, 能启动死亡受体介导的凋亡。在死亡受体(Fas、DR4和HDR5等)介导的细胞凋亡途径中, caspase-8 是关键的启动型caspase。 caspase-3是CE/CED-3家族的重要成员, 是细胞凋亡调控的重要因子之一。一般以23000相对分子质量的无活性前体存在于细胞质中, 当细胞进入凋亡时被激活, 并可促进ICE家族其他成员一起促进细胞凋亡, 被认为是多种凋亡途径的共同作用因子。　　

    Moragoda报道,姜黄素能抑制胃癌KAT0-III和结肠癌 HCT-116细胞增殖并诱导凋亡,使HCT2116细胞的细胞周期停止于G2/M期,免疫印迹结果显示两种细胞cyclinD、E水平下降,其诱导凋亡的机理是导致PARP断裂,激括caspase- 8活性,启动Fas凋亡途径。

　　Pan等研究乌龙茶多酚诱导人组织淋巴瘤U937细胞凋亡时发现, 乌龙茶多酚可通过释放细胞色素C, 活化 caspase-9、caspase-3来诱导细胞凋亡。　　

    韩国槲寄生中凝集素、桔梗属grandiflorum、姜黄素、柴胡属中的scorzonerifolium已经被发现能诱导肿瘤细胞凋亡且能抑制端粒酶活性,具有毒副作用小的优点。他们的研究均提示诱导肿瘤细胞凋亡是通过触发细胞色素 C从线粒体向胞质的释放,伴有一些caspase激活而实现的, 并可见上调bax表达和下调bcl-2蛋白表达。推测线粒体途径是主要的通路。　　

    尽管caspase-3是多种凋亡途径共同作用的因子,但并非是所有细胞凋亡途径的共同通路。有报道证实,冬凌草素甲可以诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡,表现为caspase-9依赖性,而非caspase-3 依赖性。最近,还有报道白藜芦醇 MCF-7细胞凋亡与caspase28和casDase-3的激活无关,但与 bcl-2、NF2kappaB下调有关。曲古抑菌素A也能诱导胃癌细胞凋亡,可能与P53 和bax蛋白表达增加, bcl-2 蛋白和 SurViVin蛋白表达减少有关,并独立于caspase途径,这也说明细胞凋亡可在没有caspase参与的条件下发生,存在不依赖caspase的凋亡通路。　　

    另外,某些中药诱导肝癌细胞凋亡的机理还与蛋白激酶 (PKC) 、cAMP等信息分子有关。PKC可拮抗皮质激素诱导的胸腺细胞凋亡,槲皮素作为PKC的拮抗剂,可逆转这种作用,增强机体对肿瘤细胞的吞噬能力,诱导细胞凋亡。槲皮素能降低PTK活性,抑制cAMP和cGMP的磷酸二酯酶,增加cAMP水平,降低cGMP水平,调节细胞内二者的比值,控制细胞凋亡的蛋白磷酸化,导致肿瘤细胞凋亡。

    5　展　望　　　

    随着研究工作的不断深入,细胞凋亡的研究为肿瘤治疗提供了新的思路和靶点。人们已经认识到诱导肿瘤细胞凋亡很可能是肿瘤治疗的一个新策略。但是,在中医药与细胞凋亡关系研究领域,相关中医基础理论研究明显滞后于中药作用机制研究,目前主要限于运用现代医学手段检测某些中药或方剂对肿瘤细胞的诱导凋亡作用,而缺乏对相应中医理论的探讨。因此,将传统中医基础理论与现代分子生物学有机地结合,开展“中医分子生物学”的研究,对中医药现代化研究具有十分重要的意义。