Western印迹法

Western印迹法

这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。

仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。

试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。

杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，

试剂配制：

（一）母液

1.0mol/L Tris·HCl

            Tris (MW121.14)          30.29g

             蒸馏水                 200ml

   溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

                    PH           HCl

                    7.4         约17ml

                    7.5         约16m

                    7.6         约15ml

8.0                               约10ml

1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF

          PMSF          0.174g

          异丙醇         100ml

溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。

0.2mol/L NaH₂PO₄

              NaH₂PO₄（MW119.98）          12g

                蒸馏水至                      500ml

 溶解后，高压灭菌，室温保存。

0.2mol/LNa₂HPO₄

Na₂HPO₄·12H2O（MW 358.14）  71.6g

蒸馏水至                       1000ml

溶解后，高压灭菌，室温保存。

10％SDS

             SDS                  10g

           蒸馏水至               100ml

50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

10％过硫酸胺（AP）

过硫酸胺             0.1g

                  超纯水               1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为1周。

1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）

                  Tris (MW121.14)         45.43g

                   超纯水                200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）

Tris (MW121.14)         15.14g

                   超纯水                200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

40％Acr/Bic（37.5：1）

                  丙稀酰胺（Acr）            37.5g

甲叉双丙稀酰胺（Bic）         1g

超纯水至                     100ml

37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。

20％Tween20

Tween20          20ml

蒸馏水至         100ml

混匀后4℃保存。

（二）使用液

单去污剂裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100mg/ml PMSF）：

        1mol/L Tris·HCl（pH8.0）  2.5ml

NaCl                0.438g

TritonX－100             0.5ml

蒸馏水至                50ml                 

混匀后， 4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100mg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。

0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）

0.2 mol/L NaH₂PO₄         19ml

0.2 mol/L Na₂HPO₄         81ml

NaCl                    17g

蒸馏水至              2000ml

G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）

                  考马斯亮蓝G250：  100mg

                  95％乙醇：         50ml

                  磷酸：             100ml

                  蒸馏水至           1000ml

配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。

0.15 mol/L NaCl

NaCl（MW58.44）   0.877g

蒸馏水至          100 ml

高温灭菌后，室温保存。

100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）

          BSA        0.1g

      0.15 mol/L NaCl   1ml

溶解后，－20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，－20℃保存。

10％分离胶和4％浓缩校

               10％分离胶（两块胶，10ml）               4％浓缩胶（两块胶，5ml）

超纯水                         4.85ml                         3.16ml

40％Acr/Bic（37.5：1）          2.5ml                           0.5ml

1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8）      2.5ml                           －

0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8）       －                            1.26ml

10％SDS                         100 ml                        50 ml

10%AP（过硫酸胺）              50 ml                          25 ml

TEMED                          5 ml                           5 ml

 加TEMED后，立即混匀即可灌胶。

还原型5XSDS上样缓冲液（0.25mol/L Tris·HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10％ SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油）

             0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8）    2.5ml

           二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）    0.39g

                    SDS                   0.5g

溴酚蓝                 0.025

甘油                   2.5ml

   混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。

电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％ SDS）

                Tris（MW121.14）          3.03g

                甘氨酸（MW75.07）        18.77g

SDS                        1g

蒸馏水至                 1000ml

   溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。

转移缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇）

甘氨酸（MW75.07）        2.9g

Tris（MW121.14）          5.8g 

SDS                      0.37g 

甲醇                     200ml

蒸馏水至                 1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。

10X丽春红染液

丽春红S         2g

三氯乙酸        30g

磺基水杨酸      30g

蒸馏水至       100ml

使用时将其稀释10倍。

TBS缓冲液（100mmol/ L Tris·HCl pH7.5,150mmol/L NaCl）

1 mol/ LTris·HCl（pH7.5）  10ml

NaCl                      8.8g

蒸馏水至                 1000ml

TBST缓冲液（含0.05％Tween20的TBS缓冲液）

20％Tween20        1.65ml

             TBS               700ml

             混匀后即可使用，最好现用现配。

1*TBST  1L

Tris base          2.422g  (MW121.4)

Nacl              8.775g

Tween20          0.5ml

封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）

脱脂奶粉（国产，安怡牌）          5g

TBST                             100ml

溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。

洗脱抗体缓冲液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2％SDS，62.5m mol/L Tris·HCl pH6.8）

14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇)     700 ml（通风厨里加）

               SDS                                  2g

         0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）                 12.5ml

            超纯水至                               100ml

配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1次。

显影液（5X）

              自来水（加热至50℃）      375ml    （以下药品加到温水中）

              米吐尔                     1.55g

              亚硫酸钠（无水）           22.5g

              碳酸钠（无水）             33.75g

              溴化钾                     20.95g

              补水至                     500ml

配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用自来水稀释至1倍。

定影液

自来水（50～60℃）     700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）

硫代硫酸钠           240g

亚硫酸钠（无水）     15g

冰乙酸               12.6ml

硼酸                 7.5g

钾明矾                15g（水温冷至30℃以下时再加入）

加水定容至1000ml，室温保存

抗体

      用TBST稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml

化学发光试剂

购自北京中山公司，为Santa Cruz产品，分A和B两种试剂。

操作步骤：

（一）  蛋白样品制备

（1）       单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1、  倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

2、  每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

3、  按1ml裂解液加10 ml PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

4、  每瓶细胞加400 ml含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5、  裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）

6、  于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）

7、  将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。

（2）       组织中总蛋白的提取：

1、  将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2、  加400 ml单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。

3、  几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4、  裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。

（3）       加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：

由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：

1、  将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。

2、  弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。

3、  用枪洗干上清后，加100 ml裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

4、 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。

（二）  蛋白含量的测定

（1）       制作标准曲线

1、  从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。

2、  取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0mg，2.5mg，5.0mg ，10.0mg ，20.0mg ，40.0mg。

3、  按下表在各管中加入各种试剂。

4、  混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析。

5、   

（2）       检测样品蛋白含量

1、  取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。

2、  取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。

3、  弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。

4、  取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5ml待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。

注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 ml样品含的蛋