咖啡酸苯乙酯靶向调控人结肠癌HT-29细胞FAK-ERK信号通路的研究

[摘要] 目的：探讨咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester，CAPE)对结肠癌HT-29细胞FAK-ERK信号传导通路中相关蛋白表达的作用，寻找其作用靶点，试图阐明CAPE抗肿瘤作用的分子机制。方法：用不同浓度CAPE处理HT-29细胞，利用Hoechst33258染色法和流式细胞术，检测细胞凋亡的发生。应用Western-blot法分析不同浓度CAPE对HT-29细胞中黏着斑激酶(Focal adhesion kinase，FAK)、细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)蛋白表达的影响。结果：Hoechst33258染色发现CAPE作用后凋亡细胞数量增加。流式细胞仪细胞凋亡率分析显示，0、2.5、5.0、7.5、10μg/ml处理HT-29 细胞24h后，细胞凋亡率上升，呈剂量依赖性。Western印迹结果显示：在（0-10）μg/ml范围内不同浓度CAPE作用于HT-29细胞24h后，FAK、ERK蛋白表达随CAPE浓度的增加而下调。结论：CAPE可诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡，其作用机制可能与CAPE抑制FAK-ERK信号转导通路的激活有关。

[关键词] 咖啡酸苯乙酯；结肠癌细胞HT-29；细胞凋亡；黏着斑激酶；细胞外信号调节激酶；免疫蛋白印迹

Caffeic acid phenethyl ester induces apoptosis of HT-29 colon cancer cells by inhibition FAK /ERK signal transduction pathway

LIANG Lu-chang¹ ,TANG Zhi-han¹, LI Zhen-fa², WAN Jian², XUE Wen¹, WANG Jun¹, TU Hong², HE Kui ²*

（1. Nan-hua University; Hengyang 421001，China；2.The Central Hospital of Hengyang， Hengyang 421001）

［Abstract］Objective: To explore the effects of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on expression of the related proteins in FAK-ERK signal transduction pathway in colorectal carcinoma cell line HT-29, to find out the targets and to elucidate furtherly the anti-tumor mechanism of CAPE. Methods: The cells of human colorectal carcinoma cell line HT-29 were treated with CAPE at different concentration. Flow cytometry(FCM)and Hoechst33258 staining were used to detect apoptosis. Western blotting analysis was used to evaluate the protein level of FAK-ERK in HT-29 cell treated by CAPE. Results: Hoechst33258 staining showed that apoptosis cells increased after the treatment of CAPE; The results of FCM analysis showed that cell apoptosis rate increased after exposed to CAPE in a dose dependent manner (0, 2.5, 5.0, 7.5 and 10μg/ml ) after 24 h. Western blot analysis showed that the expression of FAK-ERK protein in HT-29 cells was down-regulated with the increase of CAPE concentrations from 0 to10 μg/ml. Conclusions: CAPE can induces the colorectal carcinoma cell line HT-29 apoptosis. The mechanism of the role of CAPE suppress FAK-ERK signal transduction pathway activation.

[Key words]  Caffeic acid phenethyl ester; colorectal cell HT-29; Cell apoptosis; Focal adhesion kinase; Extracellular signal-regulated kinase; western-blot

[基金项目]  湖南省科技厅课题项目（S2009F1023）

[作者简介]  梁路昌（1985-），男，硕士研究生，研究方向为大肠癌的预防和治疗     

CAPE是一种酚类抗氧化剂，是存在于蜂胶中的一种主要活性组份，具有广泛的生物学活性，抗炎、抗肿瘤、免疫调节以及抗氧化等作用^[1]。研究发现，CAPE能诱导白血病、胆管癌、大肠癌细胞、神经胶质瘤细胞株U251、胰腺癌等多种肿瘤细胞凋亡^[2-6]。我们前期研究发现CAPE能抑制HT-29细胞增殖、诱导其凋亡^[7]。但是，CAPE抑制结肠癌细胞增殖、凋亡的分子机制复杂。近年研究发现，FAK-ERK信号转导通路参与了细胞增殖、分化、生存、迁移、凋亡和恶变等多种生物学反应，此通路的异常活化可能是肿瘤发生的机制之一^[8-11]。CAPE是否通过调节细胞内FAK-ERK信号转导通路来诱导结肠癌的增殖、凋亡尚不清楚。因此，我们用不同浓度的CAPE处理HT-29细胞，采用Hoechst33258染色法和流式细胞术等方法检测细胞凋亡的发生，并观察HT-29细胞内的FAK和ERK的蛋白表达变化情况，试图探讨CAPE抑制HT-29细胞增殖、诱导凋亡的分子机制。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  细胞来源与细胞培养  HT-29细胞系购自中南大学湘雅医学院细胞中心，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640 培养基，置37℃ 5%CO₂培养箱中贴壁培养，隔日换液，待细胞75%融合时，按1:2或1:3传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.1.2  药品与试剂 CAPE为ALEXIS公司产品；RPMI1640培养基为GIBCO公司产品；胎牛血清为杭州四季青生物工程公司产品，细胞胰酶消化液、DMSO购自天津灏洋生物公司；Hoechst33258染色试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、Western印迹及IP细胞裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、BeyoECL Plus (超敏ECL化学发光试剂盒)为碧云天生物技术研究所产品；PVDF膜、FAK、ERK（均为鼠抗人）为MILLIPORE公司产品；鼠抗人β-Actin一抗购自Auragene公司，HRP标记的羊抗小鼠二抗为Jackson公司产品。

1.2  方法

1.2.1  Hoechst33258染色荧光显微镜观察  Hoechst33258染色观察HT-29 细胞凋亡核形态学变化。取对数生长期HT-29细胞以1×10⁵个/ml接种于六孔板中进行细胞爬片。培养24h后，实验组加入CAPE（10μg/ml），对照组加相同体积的培养基，继续培养24h。弃上清，PBS漂洗2次，每次3min，加入固定液0.5 ml，4℃固定10 min，弃固定液，PBS洗2次，每次3min，滴加Hoechst33258工作液0.5ml，室温染色10min，PBS洗2次，滴一滴抗荧光淬灭封片液于6孔板板中的盖玻片上，置于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.2  细胞凋亡率分析  取对数生长期的HT-29以1×10⁶个/瓶板接种于75ml培养瓶培养，24h后吸除原培养液，加入不同浓度的CAPE；培养液中不加药物（加相同浓度的DMSO）的为对照组，继续培养24h后分别收集细胞，1000r/min，4℃离心5min后，冷PBS重悬，离心，弃上清，再次重悬离心，加5μl Annexin-V-FITC溶液和2.5μl PI到100μl细胞悬浮液中，混匀后避光反应10min，加150μl样品稀释液到样品中，混匀后上机检测。

1.2.3  Western印迹检测各蛋白表达   将HT-29细胞经浓度分别为2.5、5.0、7.5、10μg/ml的CAPE处理后,继续培养24h后收集细胞,常规提取细胞总蛋白。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳(分离胶浓度为8%和10%,积层胶浓度为5% )。电泳后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭4h后，加入一抗FAK（1:1000）、ERK（1:500），4℃孵育过夜，洗膜后加入HRP标记的羊抗小鼠二抗（1:2000），室温下摇床孵育2h。以ECL试剂盒显色。X光片感光，显影。ImagerJ软件分析条带灰度值。

1.3  统计学处理 

本实验数据以 s表示。采用SPSS 13.0软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，组间比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1  Hoechst33258染色荧光显微镜观察凋亡细胞

荧光显微镜下，对照组中细胞形态饱满，细胞DNA分布相对均匀，核无固缩，呈现体积较大的，均匀蓝色荧光，核形态规则，为圆形或椭圆形（图1A）；10μg/ml CAPE处理细胞24 h后，细胞体积变小，凋亡细胞核浓聚呈斑块状聚集致密浓染，胞内可见致密的亮蓝色强荧光（图1B）。

2.3  CAPE对HT-29细胞凋亡的影响

对照组自然凋亡率为3.5 ± 0.4%，5.0、7.5、10μg/ml CAPE作用HT-29细胞24h后的凋亡率分别为10.4 ± 0.6%、13.8 ± 0.9%、19.8 ± 1.1%，结果相比较差异有统计学意义（P<0.05、P<0.01）。表明CAPE对HT-29细胞具有诱导凋亡作用，且随着CAPE 剂量的增加，凋亡率逐渐增加，呈剂量依赖性（如图2-1、图2-2）。

图2-1  CAPE对HT-29细胞凋亡的影响（24h）

*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较

图2-2  流式细胞仪检测结果

A  DMSO对照组       B  CAPE 2.5μg/ml      C  CAPE 5.0μg/ml 

D  CAP E 7.5μg/ml      E  CAPE 10.0μg/ml

2.4　CAPE对HT-29细胞FAK、ERK蛋白表达的影响

HT-29细胞经不同浓度的CAPE作用24h后，Western印迹分析表明：细胞FAK、ERK蛋白含量均有不同程度的下降。随着 CAPE浓度的增高，各蛋白表达量逐渐下调，差异有统计学意义(表1；图3)。

表1不同剂量 CAPE对HT-29细胞FAK、ERK蛋白相对表达量的影响n=3， s

*P<0.01，与对照组比较；^#P<0.01，与2.5μg/ml比较

1-5（24h）:  0、2.5、5.0、7.5、10μg/ml CAPE

图3 不同浓度CAPE对HT-29细胞FAK、ERK蛋白表达的影响

3 讨论

结直肠癌是常见的消化道肿瘤，其发病率和死亡率在全球仍呈上升趋势，中晚期结直肠癌5年生存率仅在50%左右。CAPE是一种从蜂胶中提取的的天然化合物，具有抗癌谱广，针对性强，毒副作用小等特点，且其对肿瘤细胞具有选择性的抑制作用， 而对正常细胞几乎没有毒性作用。因而CAPE是一种具有广泛应用前景的抗肿瘤药物，其抗肿瘤机制已成为国内外研究的热点。

Avci CB等研究发现，CAPE可通过降低线粒体膜电位，诱导人急性T淋巴细胞白血病CCRF-CEM细胞凋亡^[2]。Onori P等发现CAPE可通过抑制NF-κB的转录活性，诱导胆管癌细胞凋亡，从而抑制其生长^[13]。Xiang D等用CAPE处理人结肠癌细胞株HCT116和SW480，发现CAPE可能通过下调Wnt通路中的关键信号分子β-catenin和t细胞信号因子表达，呈时间和剂量依赖性的抑制其增殖，诱导凋亡^[14]。Chen MJ等用10 mg/ml CAPE处理人胰腺癌细胞BxPC-3和 PANC-1，能明显诱导其凋亡，其机制可能与线粒体功能受损，caspase-3/caspase-7活化有关^[15]。我们利用Hoechst33258染色荧光显微镜观察和流式细胞术检测发现CAPE能显著抑制HT-29细胞凋亡，提示CAPE对HT-29具有明显的抑制生长和诱导凋亡作用。课题组研究发现，10μg/mlCAPE作用72h后对HT-29细胞的抑制率达60.03%，作用24h其凋亡率为19.8±1.1%，呈时间和剂量依赖性。

FAK是整合素介导的信号通路中的关键酶，发挥着信号通路开关的作用。目前FAK-ERK信号通路成为科研人员研究的热点。牛志云等研究认为，整合素α5β1介导的FAK-ras-ERK信号转导通路可能参与了K562细胞的增殖调控，阻断此通路可明显抑制K562细胞的增殖^[8]。Iekushi K等发现FAK-ERK通路激活，增加基质金属蛋白酶表达，促进了肝细胞生长因子诱导成纤维肌细胞凋亡^[11]。我们实验发现CAPE可诱导HT-29凋亡，通过Western印迹发现随CAPE浓度的增加FAK、ERK蛋白表达逐渐下调，差异具有显著性意义。因此，我们推测CAPE可抑制FAK-ERK信号转导通路的激活，从而抑制结肠癌细胞增殖，诱导其凋亡。但是CAPE对FAK-ras-MAPK信号转导通路靶向调控及其具体机制（如是否是通过调控其相关蛋白磷酸化）还有待进一步研究。

参考文献

[1]        玄红专, 胡福良, 顾美儿. 蜂胶中咖啡酸苯乙酯的研究进展[J]. 食品研究与开发, 2006,127(05):14-15.

[2]        Avci CB, Gunduz C, Baran Y, et al. Caffeic acid phenethyl ester triggers apoptosis through induction of loss of mitochondrial membrane potential in CCRF-CEM cells[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2010,137(1):41-7.

[3]        Onori P, DeMorrow S, Gaudio E, et al. Caffeic acid phenethyl ester decreases cholangiocarcinoma growth by inhibition of NF-kappaB and induction of apoptosis[J]. Int J Cancer, 2009,125(3):565-76.

[4]        Xiang D, Wang D, He Y, et al. Caffeic acid phenethyl ester induces growth arrest and apoptosis of colon cancer cells via the beta-catenin/T-cell factor signaling[J]. Anticancer Drugs, 2006,17(7):753-62.

[5]        郭川, 陈淳, 邓发斌, 等. CAPE对人神经胶质瘤细胞株U251凋亡作用研究[J]. 西部医学, 2010,22(10):1790-1792.

[6]        Chen MJ, Chang WH, Lin CC, et al. Caffeic acid phenethyl ester induces apoptosis of human pancreatic cancer cells involving caspase and mitochondrial dysfunction[J]. Pancreatology, 2008,8(6):566-76.

[7]        彭娟, 何葵. CAPE对人结肠癌HT-29细胞生长抑制和凋亡的作用[J]. 南华大学学报(医学版), 2010,(06):754-756+781.

[8]        牛志云, 成志勇, 刘英杰, 等. 整合素α5β1介导的粘着斑激酶和细胞外信号调节激酶信号传导通路对K562细胞增殖的影响[J]. 中山大学学报(医学科学版), 2009,30(06):728-732

[9]        Saleem S, Li J, Yee SP, et al. beta1 integrin/FAK/ERK signalling pathway is essential for human fetal islet cell differentiation and survival[J]. J Pathol, 2009,219(2):182-92.

[10]      Tan TW, Lai CH, Huang CY, et al. CTGF enhances migration and MMP-13 up-regulation via alphavbeta3 integrin, FAK, ERK, and NF-kappaB-dependent pathway in human chondrosarcoma cells[J]. J Cell Biochem, 2009,107(2):345-56.

[11]      Iekushi K, Taniyama Y, Azuma J, et al. Hepatocyte growth factor attenuates renal fibrosis through TGF-beta1 suppression by apoptosis of myofibroblasts[J]. J Hypertens, 2010,28(12):2454-61.