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　　1.厌氧菌的分离与鉴定

　　(1)标本的采集与运送：厌氧菌为人体普遍存在的正常菌群，尤多见于腔道口黏膜组织，因此标本采集过程中应避免为正常菌群所污染。标本应从正常无菌部位或通过严格无菌操作采取，如血液、胸腹腔液、心包液、脑脊液、关节液，以及通过外科无菌手术抽得的脓液;或通过特殊技术，如经纤维支气管镜取得的下呼吸道标本、由阴道后穹隆抽出的盆腔脓液等标本均不接触正常菌群，因而都属合格的标本。至于口腔和鼻咽拭子、肛拭和阴道拭子、胃与小肠内容物、咳出的痰液、未经局部消毒而排出的尿、流出的脓等标本一般不作厌氧培养，因已有污染可能，检出结果无参考意义。为避免接触正常菌群，不同部位的标本有特殊的采集方法;肺部感染痰液标本，在有经验者以经气管直接穿刺抽取较为可靠，但在严重缺氧，有出血倾向和剧咳的患者禁忌;尿液标本以经皮肤从耻骨上穿刺取得为可靠，但此法临床难以推广，目前仍以清洁中段尿为主;女性生殖道感染标本收集时应先清洁消毒阴道和宫颈，小心扩张宫颈口，然后以外套消毒指套的针筒或无菌塑料套管伸入宫颈管或宫颈内吸出分泌物，或可作子宫直肠窝穿刺，可得未污染的标本;鼻窦、其他窦道或深伤口等，可在皮肤消毒后，用空针连着导管尽可能深入抽取。怀疑有败血症者，应在用抗菌治疗前短期内采血2～3次，采血量多，阳性率高，一般血液与培养液的比例以1∶10～1∶20为宜;抗凝剂以选择多聚茴香磺酸钠为宜，因其具有抗补体、抑制血液正常杀菌活力和白细胞吞噬活性，可使细菌生长迅速，阳性率提高。此外用溶血离心法处理血标本亦可显著提高培养率。且提早出结果。标本采集后应尽量不接触空气，标本运送可采用下列方法：①针筒运送法：用于运送各种液体标本，用无菌针筒抽取标本后，排出多余的空气，针尖插入无菌橡皮塞、隔绝空气，运送至实验室;②无氧小瓶运送法：通常用以运送少量脓液，以无菌青霉素小瓶采样，瓶内装培养基0.5ml，加少量亚甲蓝或刃天青(resazurin)作为氧化还原指示剂，加盖密封；③大量液体标本运送法：装满标本瓶，即可驱除瓶中空气，加盖密封运送；③大量液体标本运送法：装满标本瓶，即可驱除瓶中空气，加盖密封运送;④组织块运送法：组织块置密闭厌氧罐中运送，罐内放入一团以酸化硫酸铜浸泡处理过的钢丝馏以吸氧;⑤厌氧菌培养袋运送法：患者标本床旁接种于预还原厌氧灭菌培养基，然后将平板放入厌氧袋中运送。棉拭子最好勿用，如系棉签采集的标本，应直接将之插入预还原培养基如硫乙醇酸钠(THIO)培养基中洗出，挤干，将洗出悬液再按上述吸出物(抽出物)接种培养基即可。

　　(2)培养：培养基于接种前必须处于无氧状态。为达到此目的，可：①初代培养用的平板应新鲜配制，4h内用完;或放人充以二氧化碳的不透气密封塑料袋中，4℃保存，1～2天内用完;②用前放入无氧环境，使预还原24～48h;③用预还原厌氧灭菌法配制的培养基，即在整个配制和分装过程中均通入二氧化碳，使培养基不接触氧;④液体培养基使用前煮沸10mm。驱除溶解其中的氧气，迅速冷却后立即接种。非选择性培养基：目前最常用者为牛心脑浸出液和布氏菌肉汤两种基础培养基，加入氯化血红素5μ/ml、维生素K110μg/ml、0.5%酵母浸出液、5%～10%羊血等制成血平皿，分别为BHIB和BRU，几能培养出所有厌氧菌。原上海医科大学与上海生物制品研究所合作试制的厌氧菌干燥培养基，经广泛应用，效果良好。选择性培养基：利用选择性培养基，可在众多的细菌中，选出主要的致病菌，可根据标本的来源，选择相应的培养基。目前常用的选择性培养基有：①卡那霉素-万古霉素溶血平皿(KVLB)。可抑制多数兼性厌氧菌，使产黑素普氏菌早期形成黑色素;如用于选择卟啉单胞菌属，万古霉素的浓度以2ng/ml或以下为宜(原配方中的浓度为7.5ng/m1);②类杆菌胆汁七叶苷琼脂(BBE)，脆弱类杆菌组细菌和死亡梭杆菌能耐胆汁，并能水解七叶灵，使培养基呈黑色，菌落周围有黑晕;③卵黄琼脂(EYA)，用于选择产气荚膜梭菌;④苯乙醇血琼脂(PEA)，抑制变形杆菌和其他肠杆菌科细菌，有利于厌氧菌的生长;⑤环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂(CCFA)，选择艰难梭菌;⑥改良Fm培养基，选择梭杆菌;⑦乳酸钠培养基，选择韦荣球菌等。在标本接种前，如能先进行直接涂片染色镜检，以了解细菌的形态和染色性，初步估计标本中的可能细菌，再选用培养基将更具针对性。厌氧菌中的放线菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属和消化链球菌属等都有不少菌种或菌株为微需氧菌，通过用同一菌落分别在有氧、无氧或5%～10%二氧化碳环境中进行培养的耐氧试验(aerotolerance test)，可测出各种细菌对氧的需求，而命名为需氧、厌氧、微需氧等不同类型的细菌。厌氧菌接种后应放入厌氧培养装置和仪器以维持厌氧环境。目前临床常用的厌氧培养装置有厌氧培养罐(anaerobic jar)，或厌氧缸、厌氧袋和厌氧箱或厌氧室(chamber)三种系统，三者对临床常见厌氧菌的检出率基本相同，但以厌氧培养罐最简便实用，厌氧培养罐可用泵抽气充气或化学方法去除操作环境中的游离氧，而以N2(80%)，CO2(10%)、H2(10%)取代，建立厌氧环境。H2在催化剂(氧化钯)存在的情况下，可与残留的氧化合而形成水。罐中可放亚甲蓝作指示剂。接种后的培养基置厌氧环境中孵育，48h后进行初次检查。如无生长继续孵育，同时再接种一平皿进行孵育，两者均无生长者作为阴性，故培养一般需1周以上才能作出结论。

　　(3)鉴定：厌氧菌的常规鉴定包括菌落形态、溶血性、色素产生、经紫外线照射有无荧光现象、菌落涂片、染色和镜检、生化反应、动力、毒力试验等;其中糖发酵试验为基本的生化反应，常规采用试管法，培养基用量大，需时长，目前已发展微量、快速、商品化的鉴定系统。国外有专供厌氧菌鉴定的多种检测系统和快速鉴定系统，使厌氧菌的鉴定标准化，并可与微机联用逐步自动化。已有下列几种鉴定系统：①推断性平皿(presumpto plates)：是由美国CDC实验室Lombard与Dowell两学者设计制成，故亦称LD琼脂，乃将多种试验集合制成专门比的平皿培养基，称为推断性平皿(pp)，pp共有pp1、pp2、pp3三种。每一种平皿划分为四个区、三个平皿共12个区(包括pp1的LD琼脂和七叶苷、卵黄与胆汁，pp2的DNA、葡萄糖、牛乳与淀粉。以及pp3的甘露醇、乳糖、鼠李糖与明胶等琼脂)可测定厌氧菌的18种不同特性。纯培养接种于pp后需在厌氧环境下孵育48h后观察结果，对照厌氧菌的分类特征，和该商品所提供的鉴定表格可作出推断性鉴定。②生化微量鉴定系统(biochemical-based minisystem)：其所进行的试验与常规检验系统测试者大多相同。但制成小形塑料条或盘。例如APl20A即为一塑料长盒，内有20个，内置试剂用以检测细菌的吲哚生成、触酶、尿素酶、七叶苷水解、明胶液化和对16种糖的发酵活力;使用本系统时，细菌混悬液加入内后需置厌氧环境中孵育24～48h，观察结果，读数可查对生产者提供的电码本。③细菌已形成酶活性的微量鉴定系统(pre-existing enzyme-based minisystem)，采用小形塑料板或卡。细菌已形成的酶与微量基质(酶作用物)作用后能发生迅速反应，菌液加入板上的内后无须置厌氧环境孵育，4h即可观察结果，已有AN-IDENT(21种试验)、Rapid ANAAⅡ(18种试验)、Microscan(24种试验)等系统生产。

　　2.气相色谱分析 主要包括细菌代谢产物和细胞成分的分析。

　　(1)厌氧菌代谢产物的气相色谱分析：厌氧菌的特点之一为代谢过程中产生各种挥发性和非挥发性短链脂肪酸以及醇类产物。不同菌属与菌种所产生脂肪酸、醇的种类和数量不同，因此可用气相色谱分析鉴定。厌氧菌产生的挥发性脂肪酸有醋酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、异己酸等;非挥发性脂肪酸有丙酮酸、乳酸、琥珀酸等，不能直接进行气相色谱分析，必须先用甲醇或三氟乙硼等酯化，生成甲基衍生物再行氯仿提取进行气相色谱分析。临床标本(如脓液等)中也可有脂肪酸累积，故可以乙醚或氯仿提取制谱分析，在收到标本1h内即可作出有无厌氧菌的初步诊断，但为确诊是何种厌氧菌必须作进一步鉴定。

　　(2)厌氧细胞成分的气相色谱分析：将细菌细胞皂化释出脂肪酸，加入甲醇甲基化后进行气相色谱分析，鉴定结果客观，重复性好。

　　3.免疫学检查及其他 荧光抗体技术(包括直接和间接)能成功地识别各种厌氧菌(如类杆菌、梭菌、梭形杆菌、短棒菌苗等)。临床厌氧菌感染中，致病菌以脆弱类杆菌(Bf)最为常见。国外虽有荧光抗体商品，但价格昂贵。国内学者从分离得的Bf中，精筛出一株Bf，制备得高价免疫血清，以荧光标记后，检测Bf，阳性率达100%，而非Bf菌荧光抗体染色均为阴性;此外亦进行了间接免疫荧光法用于诊断产气荚膜梭菌(Cp)、Bf、产黑素普氏菌、核梭杆菌等感染的研究，并与细菌培养法比较，两者的符合率相当高;用免疫酶标组化诊断Cp，与培养法和荧光抗体染色法的结果进行比较，三者的阳性率基本一致，有快速诊断价值;用酶标抗体直接染色快速诊断牙周病，与培养法比较，符合率在90%以上，方法简便、实用。国内亦已开始应用Bf DNA探针于临床，其敏感性为89.8%，特异性为97.3%。基因扩增技术亦已用于诊断研究。