1.粪便检查 在婴儿型与成人的婴儿型肉毒中毒者，粪便显微镜检查可见革兰阳性芽孢杆菌。
2.细菌培养 将可疑食物、呕吐物或排泄物加热煮沸20min后，接种于血琼脂培养基作厌氧培养，可分离出肉毒梭菌。
3.毒素试验
(1)动物试验：将检查标本浸出液饲喂动物，或作豚鼠、小白鼠腹腔内注射。可引起动物四肢瘫痪而迅速死亡。婴儿型者则可用婴儿粪便浸出液作动物试验。
(2)中和试验：将各型抗毒素血清0.5ml注射小白鼠腹腔内，随后接种标本0.5ml同时设对照组，从而判断毒素和定型。
(3)禽眼睑接种试验：将含有毒素的浸出液0.1～0.3ml，注入家禽眼内角下方眼睑皮下，出现眼睑闭合、或出现麻痹性瘫痪和呼吸困难，经数十分钟至数小时死亡，可作为快速诊断。
4.毒素检测 应用抗肉毒毒素抗体进行中和试验，检查病人血清中肉毒毒素，可对毒素分型。
肌电图检查有肌纤维颤动、单次刺激反应降低，多次刺激电势反而增高，有短持续期小波幅多相运动、电势增加等表现。可作为辅助诊断。
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